新生児マウスモデルは SARS の伝播性を特徴づける

Apr 29, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 3026 (2023) この記事を引用

1440 アクセス

35 オルトメトリック

メトリクスの詳細

SARS-CoV-2感染の研究において小動物モデルは課題となっており、ほとんどの研究者はゴールデンハムスターやフェレットを使用している。マウスには、低コスト、広範な入手可能性、規制や飼育上の課題が少ない、多用途の試薬や遺伝子ツールボックスが存在するという利点があります。ただし、成体マウスは SARS-CoV-2 を強力に感染させるわけではありません。今回我々は、臨床的SARS-CoV-2分離株の伝播を可能にする新生児マウスに基づいたモデルを確立する。私たちは、祖先 WA-1 の指向性、気道複製および伝達を、変異体アルファ (B.1.1.7)、ベータ (B.1.351)、ガンマ (P.1)、デルタ (B.1.617.2)、オミクロンと比較して特徴付けます。 BA.1 およびオミクロン BQ.1.1。私たちは、指標マウスからの感染粒子の排出のタイミングと規模における変異間の違いを特定し、その両方が接触マウスへの感染を左右します。さらに、ORF6またはORF8宿主アンタゴニストのいずれかを欠く2つの組換えSARS-CoV-2の特徴を明らかにした。 ORF8 を除去すると、ウイルスの複製が下気道に移動し、その結果、我々のモデルでは感染が大幅に遅延し、減少します。私たちの結果は、SARS-CoV-2感染のウイルスおよび宿主決定因子を特徴付ける新生児マウスモデルの可能性を実証すると同時に、この文脈におけるアクセサリータンパク質の役割を明らかにします。

世界的なワクチン接種の取り組みと自然免疫の増加にも関わらず、新たに出現した SARS-CoV-2 変異種は引き続き感染し、何百万人もの人々の健康に負担をかけています。問題となる過去の亜種には、アルファ (B.1.1.7)、ベータ (B.1.351)、ガンマ (P.1)、デルタ (B.1.617.2)、オミクロン (B.1.1.529) が含まれます。系統 XBB.1.5 は現在、2023 年前半を支配しています1。変異体は、スパイク (S)、ORF1a、ORF1b、ヌクレオカプシド (N)、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF8、ORF9b、エンベロープ (E) など、ウイルスゲノム全体の主要な遺伝子が異なります。）、メンブレン（M）。このエンベロープ糖タンパク質はこれまでのほとんどのワクチン接種戦略の標的抗原であり 2 、ウイルスの細胞侵入の鍵となる 3 ため、スパイクの変化には大きな注目が集まっています。 SARS-CoV-2 変異体に変異を蓄積する他の重要なホットスポットはアクセサリータンパク質であり、SARS-CoV-2 はそのうち 8 つをコードしており、その一部は抗ウイルス宿主応答、特に I 型インターフェロンの産生と応答のアンタゴニストとして機能します 4,5,6 。 SARS-CoV-2 ORF に関する当社の知識は、SARS-CoV-1 および他のコロナウイルスとの機能的類似性の推測、および ORF cDNA 過剰発現構築物または完全組換え SARS-CoV-27、8、9、10 を使用した機能研究から得られています。新しい変異株の出現と同時に SARS-CoV-2 感染が多数発生したことは、これらの変異株の伝播強化に関する懸念を引き起こし、新型コロナウイルス感染症のパンデミックの解決に多大な影響を及ぼしました 11。

SARS-CoV-2 変異体の分子的特徴付けは、適切な抗ウイルス戦略を開発するために不可欠です。これまでの研究では、受容体の結合と親和性、抗原回避と複製の動態、さらには病因と免疫回避を評価することによって、SARS-CoV-2 変異体の特徴付けが行われてきた 12,13。しかし、変異株の伝播と変異株特有の伝播の違いを支配する分子機構に関する比較研究はまだ不足しています。これは部分的には、フェレットやハムスターなどの現在の動物モデルに固有の制限によるものです。 SARS-CoV-2 の病因と伝播の研究には優れたモデルである 14,15,16 が、特別な住居が必要であり、指標あたりの接触動物の数が限られており、種特異的な試薬が不足しており、遺伝的物質の利用可能性がまったくないか限られています。感染の宿主要因に関する機構研究を実行するための操作。対照的に、マウスは多用途で容易に利用できる遺伝的ツールボックスを提供し、試薬も広く入手可能です。しかし、成体マウスは、感染しやすいにもかかわらず、インフルエンザウイルスなどの呼吸器ウイルスを効率的に伝染させません17。我々は以前、30 年以上細菌感染 18,19 と 7 年間感染 17,19,20,21,22 の研究に使用されてきた新生児マウス 17 を使用することで、インフルエンザウイルスのこのハードルを克服しました。このモデルは、マウスパルボウイルスの感染を研究するために他の人によっても首尾よく適用されています23。私たちの以前の研究では、インフルエンザウイルス株特異的な伝播の違い、インフルエンザウイルス伝播の防御における体液性免疫の役割、およびインフルエンザウイルスと肺炎球菌の同時感染時のシアリダーゼ発現の影響が明らかになりました17。ただし、SARS-CoV-2 についてはモデルが確立されていません。

今回我々は、同腹の子犬間でのSARS-CoV-2の伝播を可能にする新生児K18-hACE2マウスモデルを提示し、懸念される初期および現在のSARS-CoV-2変異体の伝播を並べて調べる。 (VOC)。さらに、アクセサリータンパク質ORF6またはORF8を欠く2つの組換えSARS-CoV-2の伝播を特徴付けます。私たちの研究は、SARS-CoV-2変異体感染の動態を解明するモデルの力を強調し、新生児マウスにおけるSARS-CoV-2感染に重要なアクセサリータンパク質であるORF8の証拠を提供する。私たちの扱いやすい小動物モデルは、SARS-CoV-2 の感染に関与する最も重要な要因のいくつかを解読するのに役立ちます。

インフルエンザウイルスは野生型マウスに容易に感染しますが、祖先型のSARS-CoV-2とこれまで臨床的に重要であったデルタ変異体は、ヒト版のSARS-CoV-2宿主細胞受容体であるACE2に依存しており、マウスのAce224に結合することができません。対照的に、他の多くの SARS-CoV-2 変異体は、特定の Spike 変異、最も顕著なのは N501Y を獲得しており、これによりマウス Ace225 との結合が可能になります。最終的に、アルファからオミクロンまでの一連の亜種と祖先型の SARS-CoV-2 を比較することを目的としました。これを念頭に置いて、我々はK18プロモーターの制御下でヒトACE2を発現するK18-hACE2マウスを研究に利用した26。

SARS-CoV-2 については、成体マウスにおける伝播に関するデータが不足しており、ある研究では、5E6 FFU に感染した初発マウスからの濃厚接触による SARS-CoV-2 B.1.351 (ベータ) 伝播が報告されています 27。同じケージ内で一緒に飼育されたマウス間の感染率は、接触体内のウイルスRNAの存在または陽性反応によって判定され、それぞれ41％と8％であった。感染性ウイルスは評価されていません。成体マウスにおけるインフルエンザウイルスの伝播も非効率的であり、研究グループ間で伝播事象を再現するのが困難であることと矛盾している17、28、29。このため、成体マウスモデルはインフルエンザウイルスの伝播を研究するための信頼性の低いツールとなりました。私たちの手にある成体マウスにおける SARS-CoV-2 感染の効率を調べるために、麻酔下で生後 13 週目の K18-hACE2 指数マウスに致死量 (VeroE6-TMPRESS2-T2A で滴定された 10,000 PFU) を鼻腔内感染させました。 ACE2 細胞）の祖先 SARS-CoV-2 USA_WA-1/2020 (WA-1) の細胞。感染の日から始めて、感染したインデックスマウスをナイーブコンタクトと2〜3の接触者に対して1つのインデックスの比率で共同飼育しました（補足図1a）。われわれは罹患率（体重減少）と死亡率（人道的エンドポイント）をモニタリングし、鼻孔をウイルス培地に浸すことにより非侵襲的かつ麻酔なしで縦方向の鼻腔脱落サンプルを収集した。したがって、ウイルス感染の尺度として、個々のマウスの上気道（URT）脱落の動態を縦方向に利用することができました。発作マウスとは対照的に、接触マウスでは実験終了時（発作感染後10日）までに罹患率や死亡率は観察されませんでした（補足図1b、c）。指標マウスは感染後 1 ～ 6 日目から感染粒子の排出を開始し、ウイルス排出のピークは 2 日目でした（補足図 1d）。接触動物のわずか1/9（合計11％）において、任意の時点でURT排卵サンプルから感染性ウイルスが検出されました（補足図1d）。これは、10 dpiでURTと肺に依然として感染力価を示した同じ接触動物でした（補足図1e）。ケージごとに、これは 0/3 (0%)、0/3 (0%)、または 1/3 (33%) の伝送効率を表します。並行実験で、接触血清変換による感染を測定しました（補足図1f）。ＰＢＳ感染マウスは陰性対照として機能し、亜致死量（１，０００ＰＦＵ）で感染したマウスは血清変換の陽性対照として機能した。感染後22日の実験エンドポイントで、接触マウスの1/5（20％）が血清転換したことがわかりました（補足図1f）。ケージごとに、これは 0/3 (0%) または 1/2 (50%) の透過率を表します。我々は、成体 K18-hACE2 マウスにおける WA-1 の接触感染は、効率が低く、ケージ間のばらつきが大きいにもかかわらず、実際に起こると結論付けました。したがって、インフルエンザウイルスの感染モデルと同様に、我々は次に新生マウスにおける SARS-CoV-2 感染を確立することに着手した。

まず、新生児に強力な SARS-CoV-2 感染と排出をもたらすために必要な最小ウイルス量を決定するために、用量反応実験を実施しました。私たちは、C57BL/6 K18-hACE2+/+ 雄と C57BL/6 (hACE2-/-) 雌を組み合わせて、SARS-CoV-2 WA-1 許容性 K18-hACE2+/- の子孫を作製しました。生後 4 ～ 7 日で、子犬に 3 μL の祖先 WA-1 を麻酔なしで鼻腔内感染させました。我々は、1,500、15,000、または50,000 PFUの漸増ウイルス用量を使用しました。次に、罹患率（体重増加の欠如）と死亡率（人道的エンドポイント）を監視し、鼻孔を収集媒体に浸すことによって毎日縦方向の鼻腔脱落サンプルを収集しました（補足図1g）。 1,500 PFU に感染した子犬は、感染後 3 日目 (3 dpi) までにそれ以上体重が増加せず、4 dpi までにすべて感染により死亡しました。 15,000または50,000 PFUに感染した子犬は、検出可能な体重減少が起こる前に3 dpiで死亡しました（補足図1h、i）。 1,500、15,000、または50,000 PFUに感染した子犬間の鼻排出力価は、1 dpiと2 dpiでは同様でしたが、3 dpiでは明らかになりました（補足図1j）：1,500 PFUに感染した子犬の力価は2 dpiと比較して低下しましたが、力価は2 dpiと比較して低下しました。 15,000 PFU で感染した子からの力価は 2 dpi と同じレベルのままでしたが、50,000 PFU で感染した子からの力価は 2 dpi で検出された値を超えて増加しました。 3 dpi で 1,500 PFU グループと 50,000 PFU グループの間で検出された脱落力価の差は、約 100 倍でした。これは、入力力価の増加により、モデルにおけるウイルス排出のダイナミクスを調整できることを示しています。試験した最低用量の 1,500 PFU では強力な感染が得られた一方、発端マウスが感染で死亡するまでにさらに 1 日感染が起こるため、その後の新生仔マウス感染実験では標準化された接種材料として 1,500 PFU を使用しました。

次に、新生児マウスにおける WA-1 の同腹子内伝達をテストしました。生後4〜7日のK18-hACE2+/-インデックスマウスに1,500 PFUのWA-1を感染させ、（非寛容な）母動物とその（寛容な）未処理同腹子を、接触者4〜6に対してインデックス1の割合で戻しました。マウス（図1a）。我々は最初に、接触マウスでは罹患率と死亡率の両方がインデックスマウスと比較して2〜3日オフセットされていることを観察し（図1b、c）、これは感染が成功したことを示しています。指標マウスでは、SARS-CoV-2 RNA が 1 dpi という早期に検出され、2 dpi でピークに達しましたが、一部の接触仔マウスは 2 dpi からウイルス RNA の排出を開始し、4 dpi でピークに達しました（図 1d）。熱不活化SARS-CoV-2を用いた並行実験では、脱落サンプル中のウイルスゲノムは活発なウイルス複製によるものであり、接種材料からのキャリーオーバーによるものではないことが示された（補足図1k）。したがって、接触したマウスで SARS-CoV-2 RNA が検出されることは、感染のもう 1 つの兆候でした。しかし、我々は感染を、接触したマウスにおける感染性ウイルス粒子の持続的な検出として厳密に定義します。したがって、プラークアッセイによって鼻の排出サンプル中のウイルス力価を決定しました。指標マウスからの感染粒子（図1e）は、RNA検出の開始および減少と相関していました（図1d）。接触した子犬から感染性粒子が検出されたことで、SARS-CoV-2の感染が確認された。 SARS-CoV-2 RNA の傾向と同様に、接触者の感染性粒子は 4 日目にピークに達し、5 日目と 6 日目までに減少しました。注目すべきことに、接触したすべての子犬は 4 日目までに感染性粒子を排出しており、このモデルでは 16/16 (100%) の WA-1 感染を表しています。

a 生後4〜7日のK18-hACE2+/-の子犬に1500 PFUのSARS-CoV-2 WA-1を鼻腔内感染させ、未感染の同腹子と6日間同居させた。体重と生存率を毎日監視し、個々の子犬の鼻孔を毎日ウイルス培地に浸すことによってウイルス排出サンプルを収集しました。合計 n = 4 インデックスと n = 9 接触マウスによる 2 つの独立した繰り返しからのデータ。インデックス仔犬と接触仔犬の平均体重 (b) と生存率 (c)。 SARS-CoV-2 RNAについてはRT-qPCRによって分析され（d）、感染性ウイルスについてはプラークアッセイによって分析された脱落サンプル中のウイルス量（e）。データは幾何平均 (線) と幾何標準偏差 (斜線領域) として表示されます。検出限界（50 PFU/ml）未満の個々の値は 5 に設定されました。 f 生後 4 ～ 7 日のマウス鼻咽頭における SARS-CoV-2 N タンパク質の免疫組織化学。子犬の鼻腔内に 1500 PFU の SARS-CoV-2 WA-1 を感染させ、頭部を 2 dpi で固定し、パラフィン包埋し、鼻咽頭から切片を作成し、SARS-CoV-2 N タンパク質 (黄色) と DAPI (青色) で染色しました。 ) 原子核の場合。矢印は、隣接するパネルで拡大された領域を表します。 OE、REはそれぞれ嗅上皮、呼吸上皮を示します。 BioRender.com で作成されました。

K18-hACE2 新生仔マウスの脱皮サンプル中の感染性粒子の検出は、URT における強力なウイルス感染を示唆しました。 URT 内の感染部位を空間粒度で決定するために、本発明者らは初頭仔犬の鼻咽頭に対して免疫組織化学 (IHC) を実施した。新生仔マウスの頭部をウイルス排出のピーク（2 dpi）で採取し、鼻咽頭を切断し、SARS-CoV-2 N タンパク質について染色した。上部嗅覚上皮および呼吸上皮内層でSARS-CoV-2陽性細胞を検出し、URTの細胞におけるSARS-CoV-2 WA-1の複製を実証しました（図1f）。総合すると、これらの結果は、SARS-CoV-2 の伝播に関する扱いやすい新生児 K18-hACE2 マウスモデルを確立し、検証するものです。

SARS-CoV-2 アルファおよびデルタ変異体の高い伝播性は、効率的な URT 複製と排出によって引き起こされると提案されています 30,31。これは、URT 複製がエアロゾルの生成やヒトへの感染と相関関係がないというインフルエンザウイルスの文献とは対照的です 32。新生児マウスモデルを使用して、我々は、インフルエンザウイルスの伝播効率がURT力価と相関するのではなく、排出された分泌物中の呼気ウイルスの量と相関することを実験的に再現しました17。インフルエンザウイルスの伝播はピーク排出のタイミングと規模の両方に依存することを示した研究者もいます 33,34。シリアンハムスターのSARS CoV-2でも同様の観察が見られ、綿棒からの経口ウイルス力価は空気感染排出量の代用としては不十分であったが、環境中に排出された空気感染ウイルスのピークは感染と相関していた35。

私たちのモデルにおける SARS-CoV-2 感染の指標相関を特定するために、さまざまな呼吸器区画、つまり下気道 (肺ホモジネート)、URT (気管後洗浄)、または排出された分泌物 (排出されたウイルス) におけるウイルス量を特徴付けました。我々は、祖先 WA-1 ウイルスのこれらのコンパートメント内でのウイルス複製のダイナミクスを評価することから始めました。生後4〜7日のK18-hACE2+/-の子犬に1,500 PFUのWA-1を感染させ、それぞれのサンプルタイプの感染性粒子量を1、2、および3 dpiで測定しました（図2a、b、補足図2a）。。 1 dpi では、統計的に有意ではないものの、排出力価と URT 力価は両方とも肺力価よりも高かった。 2 dpi では、排出力、URT、および肺の力価は互いに同様でした。 3 dpi では、脱落力価は低下する一方、肺力価は増加し、その結果、肺力価は脱力力価よりも有意に高くなりました。これは、我々のモデルにおいて、麻酔なしで鼻腔内に少量投与された SARS-CoV-2 WA-1 感染が時間の経過とともに URT から肺に進行することを示唆しています。

a 新生児 K18-hACE2+/- マウスを指定の SARS-CoV-2 に感染させ、ウイルス排出サンプルを毎日収集しました。 2 dpi で、ウイルス力価を決定するために気管後洗浄液と肺を収集し、免疫組織化学のために頭部を固定しました。 b–g 毎日の脱落サンプル（左）および脱落サンプル、上気道および肺（右）の 2 dpi でのウイルス量。検出限界（LOD、50 PFU/ml）未満の個々の値を 5 に設定しました。グループあたり n = 6 ～ 15 匹の子犬を少なくとも 2 回独立して繰り返したデータ。有意な p 値 (Kruskal-Wallis 検定) のみが表示されます。 h 鼻咽頭の 2 dpi での SARS-CoV-2 N の免疫組織化学。 BioRender.com で作成されました。

次に、祖先ウイルスと変異体の URT 排出ダイナミクスを比較しました。まず、クローン（プラーク精製）、スクロース精製、およびディープシーケンスされたウイルス作業ストックを生成しました。この厳格な品質管理パイプラインにより、VOC の同一性 (つまり、変異を定義する変異の存在) とその完全性 (組織培養誘発性の変異の欠如) が保証されます。次に、K18-hACE2+/- の子犬に、アルファ (B.1.1.7)、ベータ (B.1.1.351)、ガンマ (P.1)、デルタ (B.1.617.2)、オミクロン BA のいずれかを 1,500 PFU で感染させました。 .1、または Omicron BQ.1.1。まず、各分離株の感染性ウイルス排出の動態を1〜4 dpi、または子犬が感染で死亡するまで決定しました（図2a、補足図3）。祖先WA-1に感染したマウスからの脱落は、2 dpiでピークに達し、その後3 dpi減少しました（図2b）。 WA-1とは対照的に、Alphaに感染したマウスからの脱落は、1 dpiで早くピークに達し、2 dpiで急激に減少しました（図2c）。ベータに感染したマウスからの脱落も1でピークに達しましたが、アルファとは対照的に、3 dpiで減少する前に2 dpiで同じレベルに留まり、WA-1に感染した子マウスと同様の力価となりました（図2d）。ガンマおよびデルタに感染したマウスからの脱落は、WA-1と同様の傾きを持ち、2 dpiでピークがあり、その後3 dpiずつ減少しました（図2e、f）。ガンマ線に感染した子犬からの脱皮力価は、統計的に有意ではなかったものの、平均してWA-1感染した子犬からの脱落力価よりも低かった（図2e）。 Omicron 分離株 BA.1 または BQ1.1 に感染したマウスは、全体的に低レベルのウイルスを放出し、ほとんどの複製は検出限界未満でした (図 2g、補足図 2d)。ただし、これら 2 つの Omicron バリアントは、脱落速度に関して異なります。BQ.1.1 の脱落は 1 dpi でピークに達したのに対し、BA.1 は 3 dpi でピークに達しました (図 2g、補足図 2d)。したがって、私たちのモデルは、感染した子犬からのSARS-CoV-2変異型URT脱落の独特の動態を捉えることができます。

次に、各変異体のウイルス複製部位を比較し、異なるサンプルタイプにおけるウイルス量の分布が特定のウイルスごとに異なることを発見しました。アルファの場合、2 dpi での脱落力価および URT 力価は 2 dpi WA-1 と大きさが同等でしたが (図 2b、c)、肺力価は低下する傾向がありました (図 2c)。これらの肺力価の低下が、アルファの複製と脱落の早期の発症と衰退の結果であるかどうかを判断するために、アルファの脱落のピーク日である1 dpiでも3つのコンパートメント内のアルファウイルス量を分析しました（補足図2b、左パネル）。繰り返しますが、肺よりも脱落サンプルと URT サンプルで有意に高い力価が見つかりました。これは、私たちのモデルでは、1 dpi と 2 dpi の両方で、アルファが URT でよりよく複製することを示唆しています。ベータ、ガンマ、デルタについては、排出されたウイルス、URT、および肺の間の力価に有意な差は見られず、URTと下気道の両方で感染および複製し、URTから排出される能力が同等であることを示唆しています（図2d） -f)。実際、URT領域のIHCにより、WA-1、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタが効率的にURTに感染することが確認されました（図2h）。対照的に、2 dpiでのURTおよび肺のBQ1.1力価は検出できず（図2g）、IHCではURT上皮のOmicron BQ.1.1感染細胞は明らかにされませんでした（図2h）。これらの検出不可能な力価がBQ1.1の複製と脱落の早期の発症と衰退の結果であるかどうかを判断するために、3つのコンパートメントにおけるOmicron BQ.1.1ウイルス量を、同様に脱落のピーク日である1 dpiでアッセイしました。 3つのコンパートメントすべてで平均力価が依然として低く、一部のサンプルは脱落サンプルとURTサンプルで検出限界を超えていることがわかりました（補足図2c）。これらの結果は、Omicron BA.1 で得られた 1 dpi データと同様でした (補足図 2e、f)。どちらの Omicron 亜変異体でも肺では感染性 Omicron 粒子は検出されず、Omicron が新生仔 K18-hACE2 マウスでは効率的に複製しないことが示唆されました (図 2g、補足図 2e)。我々の結果は他の研究結果と一致しており、K18 モデルにはその受容体 hACE2 が存在するにもかかわらず、ハムスターとマウスでは Omicron 変異体が弱毒化されていることを示しています 24,36,37。

興味深いことに、脱落サンプル中のウイルス量は、すべてのウイルス分離株について、それぞれの後部気管洗浄液サンプルからのウイルス量と同様であり、このモデルでは、分析された SARS-CoV-2 ウイルスはウイルス排除に欠陥を示さず、したがって URT が示されていないことが示されました。シェディングは、SARS-CoV-2 URT レプリケーションのプロキシとして使用できます。

まとめると、私たちの結果は、Omicron 変異体を除いて、私たちのモデルが祖先 WA-1 と同等のレベルで SARS-CoV-2 変異体の効率的な複製と排出を可能にすることを示しています。時間的放出動態は変異型ごとに異なるため、このモデルを変異型 SARS-CoV-2 感染のメカニズムを理解するツールとして使用できます。

次に、初期から現在のパンデミック分離株に至るまでの SARS-CoV-2 変異株のパネルを利用して、感染をテストしました。生後4～7日のインデックスK18-hACE2+/-マウスを祖先型SARS-CoV-2 WA-1、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロンBA.1またはオミクロンBQ.1.1のいずれかに感染させ、未治療の新生児と同居させた。マウスを1:6〜9の比率で使用します。 WA-1、アルファ、ベータ、およびデルタに感染した指数マウスはすべて、3 dpiまでに感染により死亡しました（補足図3a〜c、e）。ガンマ線に感染した発端マウスは4dpiまでに死亡した（補足図3d）。デルタおよびオミクロン BA.1 感染指数マウスでは、罹患率 (体重増加の欠如) と死亡率が遅延し、オミクロン BQ.1.1 感染指数マウスでは、実質的な罹患率は検出されませんでしたが、完全ではあるものの遅延した死亡率が検出されました。インデックスマウス（補足図3e〜g）。指標となる子犬の死後、遅い時点で発生する伝播事象は、接触脱落の遅れの開始、または接触間の連続伝播のいずれかに起因する可能性があります。 2 つの Omicron 変異体を除いて、他の変異体を含むケージ内の接触マウスの一部またはすべてが 7 dpi までに感染で死亡しました (補足図 3)。

次に、接触した子犬からの 2 つの非重複読み取り値を使用して、感染のダイナミクスを調査しました。 1. 接触者によるウイルス獲得のタイミング: 排卵サンプル中にウイルスが少なくとも 2 回検出された場合、接触した子犬によるウイルス獲得を「伝播イベント」として定量化します (図3）。各接触者からウイルスが排出された最初の日（「感染性ウイルス陽性」）が感染の開始としてカウントされます。これにより、ウイルスの獲得を時間の関数として評価し、変異間の獲得の動態を比較することができます。ただし、この測定値は接触感染の規模を示したものではありません。 2. 接触動物の URT 排出からのウイルス力価の検出: この測定により、接触排出レベルの微妙な変動を検出できます。我々の実験で観察された排出振幅の違いは、指標マウスによる排出の変動（すなわち、指標による感染量と伝播のタイミング）、および/または接触者におけるウイルス複製適応度の違いに起因する可能性があります。接触排出力価の変化は、接触がナイーブな個人の指標となる逐次感染実験において重要となる可能性がある。 WA-1 と Alpha では、それぞれ 3 または 4 dpi で 100 % の透過率に達し、傾きに大きな違いはありませんでした (図 3a、左パネル)。祖先のWA-1とAlphaの両方の感染粒子が、一部の接触マウスでは1 dpiという早い時点で検出され、3 dpiではAlphaの方がWA-1よりも有意に高かったことから、Alphaによるわずかな感染優位性が示唆された。アルファ接触脱落力価は4 dpiでピークに達し、WA-1よりも早く4 dpiから減退しました（図3a、右パネル）。これは、アルファ指数マウスで以前に観察された脱落力価の早期低下と一致しています（図3a）。 .2c)。アルファとは対照的に、ベータ接触マウスは、WA-1と比較して獲得の大幅な遅れを示しましたが（図3b、左パネル）、同様のピーク接触力価に達しました（図3b、右パネル）。ガンマ線接触マウスは、WA-1と比較して獲得が大幅に遅延し(図3c、左パネル)、全体で73%の伝達を達成した。ガンマ線接触マウスも全体的にウイルス量が低かったが、ピーク力価までの動態およびピーク力価からの動態はWA-1の動態と同様であった(図3c、右パネル)。ガンマと同様に、デルタコンタクトマウスは獲得に関してWA-1コンタクトマウスよりも著しく遅れており（図3d、左パネル）、デルタコンタクトマウスの感染ウイルスのピークレベルはWA-1と同様でした（図3d、右パネル）。デルタに感染した接触者は、7 dpi で実験が終了するまで感染粒子を排出し続けました (図 3d、右パネル)。 Omicron BA.1接触マウスは、私たちのモデルで感染したり、感染ウイルスを排出したりしませんでした（図3e）。これは、げっ歯類ではOmicron BA.1が弱毒化され、空気感染が減少していることを示す他の報告と一致しています24、36、37。、38。興味深いことに、BA.1とは対照的に、Omicron BQ.1.1接触マウスは、我々のモデルで25％の感染を達成しました（図3f、左パネル）。 BQ.1.1。指数放出は例外的に低いウイルス力価を示し（図2g）、これはより低い感染率と低い接触放出に対応しました（図3f、右パネル）。指標動物における両方の Omicron サブバリアントのピーク脱落力価が同等に低かったことを考えると、BA.1 と BQ.1.1 の間の伝達の違いは驚くべきことでした (図 2g、補足図 2c)。ピークシェディングのタイミング (BQ.1.1 では 1 dpi、BA.1 では 3 dpi) が、モデルにおける Omicron 透過の重要な決定要因である可能性があります。全体として、私たちのデータは、指数減少の大きさが接触者への感染の成功に対応していることを示しています（補足図2g）。

新生仔 K18-hACE2+/- マウスを指定の SARS-CoV-2 に感染させ、未感染の同腹子と 1:6～9 の比率で 7 日間共同飼育しました。接触マウスにおける感染の獲得およびウイルス負荷を毎日監視した。祖先 WA-1 を、アルファ (a)、ベータ (b)、ガンマ (c)、デルタ (d)、Omicron BA.1 (e)、および Omicron BQ1.1 (f) 変異体と比較しました。左側のパネルは、逆カプランマイヤープロットにおけるウイルス獲得の割合を示しています。感染の開始は、持続的な感染性ウイルス検出の初日として記録されました。右のパネルは、プラークアッセイによって測定された接触脱落サンプル中のウイルス量を示しています。データは幾何平均（線）と幾何標準偏差（斜線領域）として表示されます。検出限界（50 PFU/ml）未満の個々の値を 5 に設定しました。少なくとも 2 回の独立した繰り返しからのデータ n = 1 インデックス、および繰り返しごとに 4 ～ 6 匹の接触子犬。有意な p 値 (カプランマイヤープロットのマンテルコックスログランク検定、ウイルス量のクラスカルウォリス検定) のみが表示されます。

次に、我々のモデルにおけるウイルス攻撃後の指標マウスの URT 炎症レパートリーを特徴付けました。感染に対する抗ウイルス/炎症反応は宿主内でウイルスを弱毒化し、感染の減少を引き起こすと予想されます5,39。しかし、炎症の増加は、ウイルスを環境中に排出するのに役立つURT分泌を誘導する可能性もあり、それが感染を促進する可能性があります20,22。熱不活化（HI）SARS-CoV-2 WA-1またはポリ（I：C）を対照として使用し、6、24、および48時間の時点でマルチプレックスELISAによって指標マウスのURT脱落サンプルに存在するサイトカインを分析しました。 WA-1感染マウスよりも低いレベルではあったものの、48時間の時点でポリ（I：C）処理マウスに複数のサイトカインの存在が検出されました（補足図4a）。 HI WA-1は、どの時点でも測定可能な炎症を誘発できませんでしたが、WA-1感染マウスのサンプルでは48時間までにサイトカインレベルの増加が検出されました（補足図4a）。これは、我々の精製ウイルスストックには外因性炎症物質が含まれていないこと、我々のモデルで炎症を引き起こすには活性なWA-1複製が必要であること、そしてURT排出サンプルのサイトカインプロファイルを測定するには48時間の時点が最適であることを示唆しています。

指標URTの炎症と感染との潜在的な関連性を探るため、祖先型SARS-CoV-2 WA-1または変異体アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロンBA.1およびオミクロンBQのいずれかに感染した指標マウスの脱皮サンプル中のサイトカインを測定した。 48 hpiで.1.1。ほとんどの変異体について、この時点での同等の感染性ウイルス排出力価（104 ～ 105 PFU/mL）（図 2）により、これらの同等に複製するウイルス間のサイトカインシグネチャの定性的比較が可能になりました。どちらの Omicron 変異体も、48 hpi でのウイルス排出力価がはるかに低く（101 PFU/mL、図 2g）、したがって、48 hpi での両方の Omicron 変異体のサイトカインサインは静かでした（補足図 4b）。特に、BQ.1.1の脱落のピーク時間である24 hpiでは、BQ.1.1感染指数のサイトカインレベルの増加が検出されましたが（図2g、拡張データ4c）、BA.1ではそのような増加は見つかりませんでした。感染マウスでは、脱落はその後、72 hpi でピークに達します（補足図 2d、補足図 4c）。同等に複製するウイルス（WA-1、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ）では、祖先WA-1感染時のサイトカインシグネチャが、変異型感染時のシグネチャと最も異なることがわかりました（補足図4b）。ガンマ署名とアルファ署名がクラスター化され、アルファ署名とデルタ署名もそれぞれクラスター化されました。重要な上方制御されるサイトカインのセットは、同等に複製するウイルス間で類似していました（補足図4b、左上の象限）が、上方制御の振幅はウイルス間で異なりました。注目すべきことに、アルファを除く、さまざまなウイルスによるサイトカインクラスター距離は、それぞれの感染効率と相関していました（補足図4d）。指標となる子犬によって誘導される特定の URT サイトカインが感染に寄与するかどうか、またある場合はどの特定の URT サイトカインが感染に寄与するかを解読するには、さらなる研究が必要です（補足図 4b および図 3）。私たちのモデルと、重要なサイトカイン経路を遮断したトランスジェニックマウスの利用可能性により、これらの将来の研究を独自に実行できるようになります。

まとめると、我々の結果は、我々の新生児マウスモデルが、SARS-CoV-2 変異種に固有の感染力学の違いを特徴付けることができることを示しています。当社の毎日のウイルスサンプリング方法により、個々のインデックスマウスおよびコンタクトマウスにおけるウイルス複製を経時的に追跡することができ、バリアント特異的なサイトカインシグネチャと伝達の関連性を含む伝達パラメータの粒度が提供されます。

スパイクの変異に加えて、いくつかの SARS-CoV-2 変異体は、ORF3、ORF6、ORF7、ORF8 などのアクセサリー遺伝子にも変異を示しており、これらは免疫シグナル伝達の干渉や宿主エフェクターの直接的な対抗作用に関与していると考えられています6、8、10。、40、41、42、43、44。これらのアクセサリータンパク質の変化による選択的利点は、もしあるとしても、特に伝達に関しては未定義のままである。そこで私たちは、特定のアクセサリータンパク質の欠如がモデルにおける SARS-CoV-2 感染にどのような影響を与えるかを判断することを目的として、2 つのアクセサリータンパク質に焦点を当てました。ORF8 には、アルファ、ガンマ、デルタの変異を定義する変異があるため、ORF6 には、この研究で利用された変異体には変異がありませんが、一部の Omicron 変異体 (つまり BA.2、BA.4) では変異があり、さらに最もよく特徴付けられている SARS-CoV-2 アクセサリータンパク質の 1 つである 1,42,43、 44. これらの組換えウイルスは両方とも、培養細胞および成体 K18-hACE2 マウスで特性評価されており 45、in vitro ではウイルス力価が低下しているが、in vivo では同様の肺力価であることが明らかになりました。興味深いことに、ORF8 を欠くウイルスは肺病理スコアの増加を示しました 45。これは、このウイルスによって誘発される炎症過程の増加を示唆している可能性があります。

K18-hACE2+/-新生児マウスに1500 PFUの組換えSARS-CoV-2 WA-1（rWA-1）、ORF6を欠く組換えSARS-CoV-2（ΔORF6）、またはORF8を欠く組換えSARS-CoV-2（ ΔORF8）。臨床WA-1分離株を用いた以前の観察（図2b）と同様に、rWA-1インデックスマウスからの脱落力価は2dpiでピークに達し、3dpiずつ減少しました（図4a、左パネル）。 ΔORF6感染マウスからの指数放出は、動態においてrWA-1と同様であり、より低い規模の傾向を示した(2dpiで5倍、図4b、左パネル)。 ΔORF8に感染した指標マウスは、rWA-1に感染したマウスよりも一貫して最大100倍少ないウイルスを排出し（図4c、左パネル）、rWA-1感染指標よりも1日長く生存しました（補足図5a〜c）。 4 dpiでもまだ抜けています。次に、指標マウスの排出サンプル (排出されたウイルス)、URT 洗浄液 (URT 複製)、および肺 (下気道の複製) におけるウイルス複製を分析しました。 WA-1分離株と同様に、URTおよび脱落サンプルよりも肺ではるかに高いrWA-1力価が観察されました（図4a、右パネル）。 ΔORF6 については、3 つのサンプルタイプすべてで平均 1×104 PFU/mL という同様の力価が得られましたが、一部の子犬では脱皮サンプルまたは URT サンプルよりも肺でより高いウイルス力価を示した広い分布がありました（図 4b、右）。パネル）。我々は、我々のモデルでは、ORF6の欠如はウイルスの複製、脱落を大幅に弱めたり、親rWA-1と比較して組織指向性を大きく変化させたりすることはないと結論付けた。 ORF8 ではこれが異なりました。 ΔORF8シェディングおよびURT力価は、rWA-1またはΔORF6よりも低かった(図4c、左パネル)。驚くべきことに、肺内のウイルス量は、rWA-1 および WA-1 ΔORF6 のウイルス量と同等でした。これは、ORF8 の欠如によって肺の力価が変化しなかった成体マウスにおける以前の所見と同様でした 41,45。したがって、ORF8 の欠如は、URT 内で特異的に堅牢に複製する ΔORF8 の能力を大幅に低下させると考えられます。

新生仔Ｋ１８－ｈＡＣＥ２＋／－マウスに、１５００ＰＦＵの組換えＷＡ－１（ｒＷＡ－１）、ＯＲＦ６欠損ｒＷＡ－１（ΔＯＲＦ６）、またはＯＲＦ８欠損ｒＷＡ－１（ΔＯＲＦ８）を鼻腔内感染させた。 ac 毎日の脱落サンプル (左) および 2 dpi の脱落サンプル、上気道 (URT) および肺 (右) におけるウイルス量。少なくとも n = 1 グループあたり 5 匹の子犬からのデータ。 df 逆カプランマイヤープロットで示されるウイルス獲得のパーセンテージと、接触脱落サンプルにおけるウイルス感染負荷量。幾何平均（線）と幾何標準偏差（斜線領域）として示されます。 n = 1 インデックスとそれぞれ 4 ～ 6 個のコンタクトを使用した少なくとも 2 回の独立した繰り返しからのデータ。 af 有意なp値(カプラン・マイヤープロットについてはマンテル・コックス・ログランク検定、ウイルス量についてはクラスカル・ウォリス検定)のみを示す。検出限界（LOD、50 PFU/ml）未満の個々の値を 5.g に設定しました。これは、マルチプレックス ELISA によって測定された気管後洗浄液および肺における 2 dpi でのサイトカインレベルを表すヒートマップです。データは、PBS を接種した子犬の 1 倍の誘導を表します。条件ごとに少なくとも n = 3 匹の子犬。 h 鼻咽頭の 2 dpi での SARS-CoV-2 N の免疫組織化学。

次に、3 つの組換えウイルスを使って感染実験を行いました。 WA-1分離株と同様に、接触によるrWA-1の獲得は1 dpiで起こり、4 dpiまでに完了し、接触脱落力価は4 dpi以降減少しました（図4d）。 ΔORF6は、接触脱落の開始、ダイナミクス、および獲得の両方において親rWA-1と同様でした（図4e）。まとめると、これらの結果は、ORF6 の欠如が我々のモデルでは伝達を大幅に減衰させないことを示唆しています。 ΔORF8の獲得の開始はrWA-1およびΔORF6と同様の1dpiでしたが、他の2つの組換えウイルスとは対照的に、獲得の傾きはより遅く、感染率は76％でした（図4f）。我々は、この伝達効率の低下は、指標マウスによる脱落力価の低下の結果であると仮説を立てています。

次に、マルチプレックスELISAによって、URTおよび指標マウスからの肺サンプルのサイトカインレベルを分析しました（図4g）。我々は、ΔORF8に感染したマウスのURTに存在するサイトカインレベルは、同じ時点（2dpi）におけるWA-1 ΔORF8力価が100倍低いにもかかわらず、rWA-1およびΔORF6に感染したマウスと同様の大きさであることを発見した。これは、URT に存在するウイルスの量と比較して、ΔORF8 の炎症サインが増加していることを示唆しています。 3つのウイルスにわたって同様のウイルス力価を示す肺では（図4g）、ΔORF8感染マウスとrWA-1感染マウスの間でサイトカインの同様のパターンが観察されました（図4g）。 ΔORF8 による炎症が特に URT でのウイルス複製を弱めるが、肺ではそうでないのかどうか、またそれがどのように弱まるのかについては、今後の研究課題となっている。注目すべきことに、rWA-1およびΔORF8感染肺の両方と比較して、ΔORF6感染肺ではサイトカインレベル、特にIL-6が上昇しており、ORF6を欠く組換えウイルスが新生児の肺における特定のサイトカインの産生を抑制できないことを示唆している。ネズミ。

我々の結果を総合すると、SARS-CoV-2のアクセサリータンパク質の1つであるORF8の除去がどのようにURT複製を減少させ、その結果、新生児マウスの脱落と感染が減少するかを示している。私たちの新生児マウスモデルは、空間粒度におけるこれらの分子プロセスに関する独自の見解を可能にし、マウス特異的試薬の利用可能性により、URTの複製と伝達におけるORF8の役割に関する将来の機構研究が可能になります。

SARS-CoV-2 感染のマウスモデルは、新たな SARS-CoV-2 変異体の病因を研究するために広く利用されてきました46、47、48、49、50、51、52。ただし、成体マウスはSARS-CoV-2を強力には伝染させません（補足図1a〜fおよび参考文献27）。私たちの研究では、インフルエンザAウイルスに関する以前の経験に基づいて、SARS-CoV-2ヒト分離株の伝播を特徴付ける新生児マウスモデルを開発および検証しました（図1および参考文献17）。初期から現在のパンデミックヒト分離株にわたる独自のSARS-CoV-2パネルを使用して、変異固有の変異が指向性と脱落（図2）、伝達（図3）、および上気道サイトカインレパートリー（補足図）にどのような影響を与えるかを実証します。４）。最後に、私たちの研究は、新生児マウスにおけるウイルスの上気道の複製、炎症、および感染におけるアクセサリータンパク質ORF8のこれまで評価されていなかった役割を明らかにし（図4）、SARSのウイルスおよび宿主の分子決定因子を研究するための私たちのモデルの力を示しています。 -マウスにおけるCoV-2感染。

私たちのモデルには、SARS-CoV-2感染の既存の動物モデルに比べていくつかの利点があります。まず、利用可能な幅広いノックアウト動物に適しているため、感染に重要な宿主因子を決定する将来の体系的な研究が可能になります。第二に、他の動物モデルよりも多数の接触新生マウスを容易に達成できるため、私たちのモデルは検出力のある研究を可能にします。第三に、ハムスターやフェレットと比べて、マウスの飼育は困難が少なくなります。さらに、マウス特異的な試薬やツールが利用できるようになったことで、宿主におけるウイルス誘発性の免疫経路や、空気の流れや肺活量などの感染に影響を与える可能性のある呼吸機構を研究できる可能性が高まりました。最後に、非侵襲的サンプリングにより、指標の進行と接触感染を縦断的に追跡できます。これにより、個人レベルでのウイルス排出とURTウイルス量の動態についてのより詳細な洞察と洞察が得られ、感染効率についての理解が深まります。

これらの特徴により、私たちのモデルは SARS-CoV-2 感染を研究するためのユニークで実行可能なツールとして確立されていますが、ハムスターやフェレットなどの他の動物モデルには、私たちのシステムの限界を超える特定の利点があります。私たちのモデルの限界の 1 つは、乳を飲んでいるマウスを互いに、または母親から引き離すことができないため、感染様式を実験的にテストできないことです。このモデルにおける感染は、人間の場合と同様に、モードの組み合わせによって発生する可能性があります 53,54。人間でも起こり得る長距離エアロゾル感染55は、現在の実験装置では測定できません。それにもかかわらず、このモデルは、ヒトとより古典的な動物モデル系の両方で示されているように、インフルエンザウイルスとSARS-CoV-2の両方の感染に有利な行動状況を特徴としている：長時間の曝露56、閉鎖空間での個人の近接57、家族との同居54、 58、59、60。さらに、個々の子犬からの当社の非侵襲的サンプル収集方法により、呼吸器ウイルス感染において重要な要素であるウイルス排出の時間的動態と振幅を長期的に測定することができます17、33、34、61、62、63。我々のモデルのもう1つの制限は、hACE2導入遺伝子の発現が非天然のK18プロモーターによって駆動され、複数の臓器の感染を可能にし、内因的に発現されたマウスAce249,50とは異なる組織発現レベルをもたらすことである。この発現は非生理的ではありますが、マウスにおける SARS-CoV-2 感染の最初の研究には、意図的に K18-hACE2 マウスを選択しました。これは、私たちの目的が、初期および現在のパンデミック分離株の感染を調査および比較することであったためです。ネズミAce2と交戦する。我々は、モデルにおける向性の変化をヒトの向性へ外挿することには、特にこれらの変化が変異体スパイク-ACE2結合の変化によってのみ、すなわちスパイクの受容体結合部位の変異によってもたらされる場合には、注意が必要であることを認識している。しかし、プロテアーゼ発現と炎症または拮抗作用はhACE2導入遺伝子によって混ざらないため、スパイク処理の違いおよび/または宿主ウイルス相互作用の違いによってもたらされる指向性の変化は、私たちのモデルを使用して容易に解釈できると主張します。まとめると、私たちの研究は、それぞれの動物モデルが SARS-CoV-2 の生物学に関する貴重で重複のない情報を提供できるため、利用可能な動物モデルの中から研究範囲と状況に基づいて選択する方法を示しています。

私たちのモデルでは、Omicron BA.1 を除いて、33% 以上の SARS-CoV-2 変異型感染が観察され、私たちの方法は変異型間の微妙な違いを検出するのに十分な粒度でした。たとえば、アルファの URT レプリケーションの初期ではあるが狭いピークを特定し、送信には短いウィンドウしか残していませんでした。それにもかかわらず、接触動物は祖先 WA-1 と同様の速度でアルファを獲得し、3 dpi では著しく高い接触力価を示すことさえあります。実際、WA-1 と同等かそれ以上の伝播効率を持つ唯一のウイルスは Alpha でしたが、他のすべての亜種は WA-1 と比較して伝播に大幅な遅延を示しました。アルファ後の変異体は、事前の感染または免疫化によってもたらされた広範囲にわたる集団免疫の後に発生し、変異体のスパイク遺伝子の変異によるウイルスの中和回避は十分に文書化されている64、65、66、67、68、69、70。したがって、我々は、WA-1と変異体ベータからデルタの間の伝播の違いは、適応免疫圧の下ではそれほど劇的ではなかったのではないか、あるいは現在ほとんどの予防接種レジメンが適合している祖先ウイルスと比較して、これらの変異体が伝播に有利であることさえ明らかにしているのではないかと推測している。このモデルを用いた将来の研究では、妊娠前の母動物へのワクチン接種による適応免疫圧力が導入される予定です。子孫は胎盤経経または乳汁を介して免疫グロブリンを獲得します。これにより、インフルエンザ A ウイルスモデルでは感染が減少することが示されています 17。

SARS-CoV-2 のアクセサリータンパク質 ORF8 は、SARS-CoV とタンパク質の同一性が 20% しか共有されていないため、おそらく最も謎に満ちています。 SARS-CoV-2 の場合、ORF8 は分泌糖タンパク質 40,71,72 であり、IL-17A 模倣 73,74、インターフェロン I 型経路の干渉 43、ヒストン模倣 75、MHC クラスの下方制御など、多様な免疫調節機能が提案されています。ただし、ORF8 の機能と作用機序の全範囲はまだ解明されていません 78。私たちのモデルでは、ORF8 の欠失により、特に URT での複製が減少しました。 URT内のΔORF8について我々が観察した炎症性サイトカインの大きさ（図4）は、そのコンパートメント内のウイルスの量が100分の1であるにもかかわらず、親のWA-1またはΔORF6ウイルスのものと同様でした。この炎症の増加は、成体 K18-hACE マウスにおける以前の観察と同様でした 41,45。 ORF8 がなければ、SARS-CoV-2 は URT における重要な抗ウイルス反応を抑制できない可能性があります。我々は、URT複製の減少とその結果としての脱落の減少が、マウスにおけるΔORF8の伝達の遅延と減少の原因であると主張する。さらに、これらのウイルスは組織培養中および新生児および成体K18-hACE2マウスの両方の肺で効率的に複製するため、これはORF8を欠くSARS-CoV-2の全体的な弱毒化によるものではないと主張する（図4および参考文献45）。）。私たちの知る限り、これはマウスにおける SARS-CoV-2 アクセサリータンパク質のコンパートメント特異的役割に関するこれまでの唯一の報告です。 ORF8 の URT 特異的役割の根底にあるメカニズムは依然として不明ですが、SARS-CoV-2 感染によって引き起こされる抗ウイルス炎症プロセスが、URT では下気道のプロセスとは異なる可能性があります。たとえば、URT と LRT の間の細胞環境と温度の違いは、これらの区画におけるウイルスの挙動と感染への反応に役割を果たしている可能性があります。さらに、関連するコロナウイルス間での ORF8 の保存性の低さ 78、2020 年 2 月の患者における SARS-CoV-2 分離株の ORF8 における 382 ヌクレオチドの欠失の出現、および切断されたバージョンを含む SARS-CoV-2 分離株の流通2020 年 3 月から 10 月までの ORF8 は 79、ORF8 が SARS-CoV-2 の適応と進化のホットスポットであることを示唆しています 78。たとえば、我々の研究でも特徴付けたアルファ変異体は、ORF8 のアミノ酸 27 に終止コドンを持ち、その結果、切断された ORF8 タンパク質が発現します1。興味深いことに、我々のモデルでは、ΔORF8 とアルファは、URT 複製、サイトカイン応答、または伝達の観点から表現模倣しませんでした。 alpha の短縮された ORF8 が、URT レプリケーションに重要な機能を保持している可能性があります。もう一つの可能性は、アルファのORF8は機能していないが、他のウイルスタンパク質（その一部はWA-1のバックグラウンドとは異なる）が、アルファのORF8作用の欠如を補う冗長な免疫抑制機構を提供しているというものである。さらなる組換えSARS-CoV-2を用いた将来の研究により、さまざまな仮説のもつれを解くことが可能になるでしょう。

私たちのモデルにおける SARS-CoV-2 感染の決定要因は何ですか? 私たちのデータは、感染指数排出力価のレベルが伝播効率に関して重要であることを示唆しています。テストされた Omicron バリアントと ΔORF8 の両方で示されるように、インデックスシェディングのレベルが低いほど、伝送効率の低下と相関があることがわかりました。さらに、WA-1 に対する Alpha のわずかな透過優位性と、BA に対する Omicron BQ.1.1 の明確な透過優位性によって示されるように、インデックスシェディングのピークの早いタイミング (1 dpi 対 2 または 3 dpi) が伝送効率に有利であることがわかります。 .1。最後に、URT ウイルス力価が、この研究でテストされたすべてのウイルスの排出力価と相関していることがわかり、全体として、効率的で早期に開始する URT 複製が、私たちのモデルにおける SARS-CoV-2 の伝播効率を決定することを示唆しています。対照的に、私たちのモデルでは、SARS-CoV-2の排出とLRTのウイルス力価の間に関連性がないことがわかりました。これは、肺に存在するウイルスが病気の原因ではなく、主に原因である可能性を示唆しています。その伝達を促進します。

要約すると、我々は新生児K18-hACE2トランスジェニックマウスを用いて、ウイルス指向性と伝播に対する変異固有変異の最終的な影響を特徴付け、伝播に対するアクセサリータンパク質の寄与を明らかにするSARS-CoV-2伝播モデルを確立した。この扱いやすい動物モデルを使用して SARS-CoV-2 感染の根底にある分子機構を解明することは、優れた抗ウイルス療法の開発を導き、SARS-CoV-2 だけでなく呼吸器ウイルス全般に対するより深い理解に貢献する可能性があります。

Vero E6 細胞は ATCC (CRL-1586) から入手し、10% ウシ胎児血清 (FBS) (Atlanta Biologicals)、1% Pen/Strep (Gibco) および 1% を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Gibco) で培養しました。 % アムホテリシン B (Gibco)、37 °C、5% CO2。 Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 は BEI Resources (NR-54970、RRID: CVCL_C7NK) から入手し、4 mM L-グルタミン、グルコース 1 L あたり 4500 mg、1 mM ピルビン酸ナトリウムおよび 1500 mg を含む DMEM (Corning) で培養しました。 10% ウシ胎児血清および 10 μg/mL ピューロマイシン (Sigma) を添加した L 重炭酸ナトリウム (37 °C、5% CO2)。両方の細胞株は、到着時および毎月の間隔でマイコプラズマを含まないことが確認されました。

C57BL/6 J および K18-hACE2 C57BL/6 J (系統 2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) マウス (ジャクソンラボラトリーズ、メイン州) を従来の動物施設で維持および飼育しました。伝染実験用の新生児ヘテロ接合 K18-hACE2 C57BL/6 J マウスを作製するために、C57BL/6 J 雌をホモ接合 K18-hACE2 C57BL/6 J 雄と交配させました。すべての実験中、子犬は母親と一緒に飼育されました。すべての実験には雌雄の実験動物が使用され、分析のためにグループ化されました。動物実験は、NYU グロスマン医科大学 (ニューヨーク州ニューヨーク州) の動物バイオセーフティレベル 3 (ABSL3) 施設で、バイオセーフティマニュアルおよび標準操作手順に従って実施されました。この研究は、ニューヨーク大学グロスマン医科大学動物管理使用委員会 (IACUC) により、IACUC プロトコール # IA18-00071 (Dittmann) に基づいて倫理的承認を得ました。

感染した動物を含む感染性 SARS-CoV-2 分離株および組換えウイルスを使ったすべての研究は、メリーランド大学 (メリーランド州ボルチモア) およびニューヨーク大学グロスマン医科大学 (新規) の動物バイオセーフティレベル 3 (ABSL3) 施設で行われました。ニューヨーク州ヨーク）。両施設はそれぞれの地域の保健省に登録されており、この原稿の提出から1年以内に疾病管理予防センター（CDC（疾病管理センター））による検査に合格している。 ABSL3 施設は、バイオセーフティマニュアルと標準操作手順に従って運営されており、これには、認定されたバイオセーフティキャビネットと、清潔なエリアから汚染の可能性のあるエリアに向けて持続的な指向性の気流を提供する施設の密閉換気システムを使用したバイオハザードエアロゾルの封じ込め、および HEPA が含まれます。濾過された排気。施設内で発生する生物有害廃棄物は、承認された消毒剤を使用して完全に除染され、その後、規制医療廃棄物として加圧滅菌および焼却されます。 ABSL3 施設へのアクセスは、労働衛生監視プログラムに登録し、OSHA 承認の呼吸用保護具、目の保護具、防漏つなぎ服、二重手袋などの適切な個人用保護具 (PPE) を着用している、認定および権限を与えられた職員に限定されます。 ABSL3 施設の外で分析する場合、感染性サンプルは精査された不活化方法を使用して徹底的に処理されました。

感染性 SARS-CoV-2 分離株および組換えウイルスに関するすべての研究は、メリーランド大学医学部およびニューヨーク大学グロスマン医学部の施設内バイオセーフティ委員会 (IBC) の事前承認を得て実施されました。 SARS-CoV-2変異株分離株の輸入許可がCDCによって承認された。組換え SARS-CoV-2 ウイルスの生成は、メリーランド大学医学部の IBC (施設内バイオセーフティ委員会) によって MF に対して承認されました。

以下の試薬は、BEI Resources、NIAID、NIH (国立衛生研究所) を通じて入手しました: SARS 関連コロナウイルス 2、分離株 USA-WA1/2020、NR-52281、疾病管理予防センターにより寄託されました。 SARS関連コロナウイルス2、分離hCoV-19/イングランド/204820464/2020、B.1.1.7、NR-54000、Bassam Hallis氏寄稿。 SARS 関連コロナウイルス 2、分離 hCoV-19/南アフリカ/KRISP-EC-K005321/2020 (NR-54008)、Alex Sigal と Tulio de Oliveira による寄稿。 SARS-関連コロナウイルス 2、分離物 hCoV-19/日本/TY7-503/2021 (ブラジル P.1)、NR-54982、国立感染症研究所提供、SARS-CoV-2 デルタ変異体、分離物 hCoV19/米国/ PHC658/2021、B.1.617.2、NR-55611。 SARS-CoV-2 Omicron BA.1 (hCoV-19/USA/GA-EHC-2811C/2021、EPI_ISL_7171744) は、エモリー大学の Suthar Lab のご厚意により提供されました。 SARS-CoV-2 hCoV-19/USA/CA-Stanford-106_S04/2022 (Omicron BQ1.1、EPI_ISL_15196219) は、Mehul Suthar 博士 (米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学) および Benjamin Pinsky 博士 (スタンフォード) から入手しました。米国カリフォルニア州スタンフォード大学）。 USA-WA1/2020 株は前述のように生産されました80。他の SARS-CoV-2 ウイルスは、1 μg/ml の 1-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン (TPCK)-トリプシンを補充した Vero E6 細胞で 1 回継代し、ウイルスによる Vero E6 細胞への適応を回避しました。 TMPRSS2 発現の欠如。細胞は 0.01 の MOI で感染し、50% の細胞変性効果 (CPE) で回収されました。回収後、25% ショ糖クッションを使用して 25,000 RPM で 3 ～ 4 時間ウイルスを精製し、感染前に PBS (リン酸緩衝生理食塩水) を使用して再懸濁しました。 B.1.1.7、B.1.1.351、および P.1 のストックについては、アリコートを最初にプラーク精製し、配列決定して変異サインを検証した後、TPCK トリプシンの存在下で増殖させて継代 1 の作業ストックを生成しました。ショ糖クッションによるウイルスペレット化ステップに進む前に、ベンチトップ遠心分離による細胞破片排除ステップを実行します。次に、ペレットを少量で再懸濁し、高濃度の精製された SARS-CoV-2 ストックを生成します。 WA-1 ΔORF6、WA-1ΔORF8、およびその WA-1 コントロールは、メリーランド大学医学部のフリーマン研究室で生成されました 61。アリコートを実験用に提供されたものとして使用した。熱不活化 (HI) SARS-CoV-2 WA-1 の場合、ウイルスストックを 56 °C で 5 時間インキュベートしました。感染性粒子が完全に不活化されていることを確認するために、サンプルの力価を測定しました。

上記のように感染した子犬は、人道的な IACUC 承認手順に従って 2 dpi で安楽死させられました。鼻の構造を保存するために頭の皮膚を丁寧に取り除きました。次に、頭部を取り外し、4 °C の PBS に浸して簡単に洗浄した後、振盪せずに 4 °C で 72 時間、4% パラホルムアルデヒドで固定しました。次に頭部を 4 ℃ で PBS 中で穏やかに振盪しながら 20 分間洗浄し、続いて 0.12 M EDTA 溶液中で 4 ℃ で穏やかに振盪しながら 7 日間脱灰しました。次に、無傷の頭部を、ライカペロリス自動組織プロセッサーで段階的にエタノールからキシレンまで処理し、パラフィンを浸透させました。製造業者の指示に従って、パラフィン包埋切片を Leica BondRX で免疫染色しました。簡単に説明すると、脱パラフィン切片を Leica ER2 バッファー (pH9、AR9640) で 20 分間加熱回復し、続いて Rodent Block (Biocare、RBM961 L) で処理した後、SARS-CoV-2 N タンパク質抗体 (クローン 1C7C7、クローン 1C7C7、 Cell Signaling Technology、カタログ番号 68344) を 1:300 希釈で、AF594 結合ヤギ抗マウス二次溶液 (ThermoFisher、カタログ番号 A11005) を 1:100 で使用します。スライドをDAPIで対比染色した。半自動画像取得は、Vectra® Polaris マルチスペクトルイメージングシステムで実行されました。 20 倍でスライド全体をスキャンした後、Akoya Biosciences の InForm® バージョン 2.6 ソフトウェアを使用して、スペクトル分離および画像解析のためのフィールドを選択するために組織の輪郭を手動で作成しました。研究画像データは、OMERO Plus v5.6 (Glencoe Software) を使用して管理され、表示、注釈、および/または OMERO.figure v 4.4 (OME チーム) による図作成が行われました。

成体 C57BL/6J K18-hACE2+/- ヘミ接合マウス (13 週齢、雌雄) に、10 μL の鼻腔内感染を介して致死量 (10,000 PFU) の祖先型 SARS-CoV-2 USA_WA-1/2020 を感染させた。ケタミン/キシラジン麻酔。雄マウスと雌マウスを、感染指数と非感染接触比が 1:3 となる 4 匹のグループに分けて飼育しました。ウイルスの排出は、各マウスの鼻孔をウイルス培地 (PBS プラス 0.3% ウシ血清アルブミン [BSA]) に 10 日間毎日 3 回浸すことによって収集されました。ケージ内感染は、接触マウスにおける感染性粒子の存在によって決定されました。獲得率は以下のようにスコア化され、表示されます。瀕死の状態の患者は、人道的エンドポイント基準が満たされた場合、CO2窒息とそれに続く頸椎脱臼によって安楽死させられた。 10 dpi で、生き残った動物を CO2 窒息とそれに続く心臓穿刺によって安楽死させました。 500μLの無菌PBSを気管を通して鼻孔から押し出すことによって、生存動物の上気道の逆気管洗浄を行った。肺を収集し、以下に記載するようにステンレス鋼ビーズで均質化した。

感染による血清変換を評価するために、成体マウス（１３週齢）を上記のように感染させ、感染指数：非感染接触者が１：３および１：２のグループに分けて飼育した。 13週齢の雄マウスに10μLの滅菌PBSを接種し、12週齢の雌マウスに10μLの亜致死量のSARS-CoV-2 USA_WA-1/2020（1000PFU）を接種した。マウスの体重と生存率を毎日監視した。感染後 3 週間で、CO2 窒息とそれに続く心臓穿刺によって動物を安楽死させました。ＵＲＴの後方気管洗浄および肺ホモジネートを上記のように収集した。 1 mL 28G1/2 インスリン注射器を使用して心臓穿刺により血液を採取し、血清採取チューブ (BD Microtainer 365967) に加えました。血液凝固を促進するためにチューブを室温で 45 分間インキュベートし、その後 4 °C で 10 分間遠心分離しました (1500 × g)。血清を分離し、-80 °C で凍結し、Spike Trimer (Acro Biosystems RAS-T023) に対する IgG 抗体の存在を分析しました。

新生仔マウスは、生後 4 ～ 7 日のマウスとみなされました。個々の子犬の性別は決定されていないため、新生児マウスを使ったすべての実験には両性の動物が使用された可能性があります。子犬は、全身麻酔なしで（肺への直接接種を避けるため）1500 PFUのSARS-CoV-2 WA-1、SARS-CoV-2変異体または組換えSARS-CoV-2を鼻腔内点滴注入することにより、3μLの滅菌PBS接種材料で感染させた。実験期間中は授乳ダムに戻りました。伝播実験では、図の凡例に示すように、1 頭または 2 頭の子犬が感染し、実験期間中 (未感染の) 同腹子に戻されました。各マウスの鼻孔を毎日 3 回ウイルス培地 (PBS プラス 0.3% ウシ血清アルブミン [BSA]) に浸すことによってウイルスの排出物を収集し、定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) またはプラークアッセイによってサンプルを評価しました。同腹子（接触）の脱皮サンプルを毎日収集することにより、同腹子内感染を評価した。 % 取得は、逆カプランマイヤープロットで視覚化されました。感染事象は、排出サンプルにおける少なくとも 2 日間の感染ウイルス力価として記録されました。感染の開始は、感染性ウイルスが検出された最初の日として記録されました。子犬と母犬はCO2窒息とその後の心臓穿刺によって安楽死させられた。上気道（URT）を逆気管洗浄（気管から 300 μL の PBS を流し、鼻孔を通して収集）を行い、サンプルを使用してウイルスを定量しました（プラークアッセイまたは qRT-PCR 経由）。接触子に対するインデックスの比は、バリアント比較の場合は 1:6 ～ 9、WA-1 によるモデル最適化の場合は 1:3 ～ 1:4 の範囲でした。

RNA抽出は、Qiagen QIAamp Viral RNAキットを使用して実行されました。 μL あたりのウイルス N コピー数は、Taqman® RNA-to-CT ワンステップ RT-PCR キット (Applied BiosystemsTM) を使用し、SARS-CoV-2 プライマーと N 内のアンプリコンを標的とするプローブを使用した RT-qPCR によって定量されました。 SARS-CoV-2 WA-1 のタンパク質 (順方向: 5'ATGCTGCAATCGTGCTACAA3'、逆方向: 5' GACTGCCGCCTCTGCTC3') およびプローブ 5'/56-FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/3'。インビトロで転写された SARS-CoV-2 N RNA 配列 (MN985325.1) を使用して、各データセットの標準曲線を作成しました。

感染性ウイルス力価はプラークアッセイにより測定した。簡単に説明すると、DMEM + 1% 抗生物質/抗真菌薬 (Gibco) 中の各ウイルスの 10 倍希釈物を、単層 Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 細胞に 37 °C で 1 時間添加しました。インキュベーション後、2% FBS を含む DMEM 中の 0.8% アガロースを細胞に重層し、37 °C で 36 時間インキュベートしました。細胞を10%ホルマリンで固定し、アガロースプラグを除去し、クリスタルバイオレット染色でプラークを視覚化しました。マウス実験から得られたストックおよびサンプル (脱落、洗浄、および肺のホモジネート) を、Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 で力価測定しました。

肺を 1 個のステンレス鋼ビーズ (QIAGEN) を含む 500 μL の DPBS に収集し、Tissue-Lyser II (QIAGEN) でホモジナイズし、破片を 8000 rpm で 8 分間引き下げました。ウイルス力価は、Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 細胞を使用したプラークアッセイによって決定されました。

Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay (Bio-Rad) を使用して、マウス血清中のサイトカインおよびケモカインのレベルを測定しました。サイトカインおよびケモカインは、MAGPIX 装置 (Luminex) で記録され、標準曲線との比較によって定量されました。データ収集と分析には、xPONENT バージョン 4.3.229.0 ソフトウェアを使用しました。各タンパク質について実験的に得られた検出限界を使用し、その検出限界未満の値を限界より 1 対数下回る値に設定しました。すべてのサンプルは、PBS 処理動物からのサンプルに対して正規化されました。クラスター化ヒートマップは、ComplexHeatmap パッケージ v.2.14.0 を使用して生成されました。

すべての統計分析は、GraphPad Prism 9.5 を使用して実行されました。各実験は、図の凡例に別段の記載がない限り、内部の生物学的複製を用いて少なくとも 2 回独立して完了しました。データは幾何平均値 ± 幾何標準偏差 (SD) として表されます。 Kruskal-Wallis 検定とログランク Mantel-Cox 検定が実行され、図の凡例に具体的に示されました。 p 値 < 0.05 のみが図に表示され、p 値 > 0.05 は有意ではないとみなされました (ns)。

生物学的複製の正確な数 (n) は次のとおりです。

図1

b インデックス n = 4、コンタクト n = 9

c インデックス n = 4、コンタクト n = 9

d インデックス n = 4、コンタクト n = 9

インデックス n = 4、コンタクト n = 9

fn = 1 マウス

図2

縦方向の脱落の場合は bn = 8、2 日目のサンプリングの場合は n = 7

縦方向の脱落の場合は cn = 15、2 日目のサンプリングの場合は n = 13

縦方向の脱落の場合は dn = 7、2 日目のサンプリングの場合は n = 5

縦方向の脱落の場合は en = 8、2 日目のサンプリングの場合は n = 6

縦方向の脱落の場合は fn = 7、2 日目のサンプリングの場合は n = 5

縦方向の脱落の場合は gn = 12、2 日目のサンプリングの場合は n = 5

hn = SARS-CoV-2 変異体あたり 1 匹のマウス

図3

縦方向の脱落の場合は an = 12、カプランマイヤープロットの場合は n = 12

縦方向脱落の場合は bn = 27、カプランマイヤープロットの場合は n = 27

縦方向脱落の場合は cn = 14、カプランマイヤープロットの場合は n = 14

縦方向脱落の場合は dn = 15、カプランマイヤープロットの場合は n = 15

縦方向脱落の場合は en = 13、カプランマイヤープロットの場合は n = 13

縦方向の脱落の場合は fn = 8、カプランマイヤープロットの場合は n = 8

縦方向脱落の場合は gn = 12、カプランマイヤープロットの場合は n = 12

図4

縦方向の脱落の場合は an = 7、n = 5 2 日目のサンプリング

縦方向の脱落の場合は bn = 8、n = 6 2 日目のサンプリング

縦方向の脱落の場合は cn = 10、2 日目のサンプリングでは n = 8

縦方向脱落の場合は dn = 12、カプランマイヤープロットの場合は n = 12

縦方向の脱落の場合は en = 14、2 日目のサンプリングでは n = 14

縦方向の脱落の場合は fn = 13、2 日目のサンプリングでは n = 13

個々の URT サンプルの場合は gn = 19 (PBS n = 6、r-WA-1 n = 4、ORF6 n = 5、ORF8 n = 4)、個々の肺サンプルの場合は n = 21 (PBS n = 6、r-WA- 1 n = 5、ORF6 n = 5、ORF8 n = 5)

hn = SARS-CoV-2 変異体あたり 1 匹のマウス

補足図1

b 重量: インデックス n = 3 (m = 2、f = 1)、コンタクト n = 9 (m = 6、f = 3)

c 生存曲線: インデックス n = 3 (m = 2、f = 1)、コンタクト n = 9 (m = 6、f = 3)

d 縦方向の脱落: インデックス n = 3 (m = 2、f = 1)、コンタクト n = 9 (m = 6、f = 3)

エンドポイント肺力価: 連絡先 n = 9 (m = 6、f = 3)

f 血清変換 (対照および接触): n = 11 (PBS n = 3 (m = 3)、亜致死 n = 3 (f = 3)、接触 n = 5 (m = 2、f = 3))

h 重量: n = 12 (1500 PFU n = 6、15000 PFU n = 3、50000 PFU n = 3)

i 死亡イベント: n = 21 (1500 PFU n = 9、15000 PFU n = 9、50000 PFU n = 3)

j 縦力価: n = 12 (1500 PFU n = 3、15000 PFU n = 3、50000 PFU n = 3)

k 縦方向脱落: n = 11

補足図 2:

縦方向コンパートメント力価: 1日目: n = 5、2日目: n = 7、3日目: n = 4

b 縦方向コンパートメント力価: 1日目: n = 11、2日目: n = 13

c コンパートメントの力価: 1 日目: n = 6

d 縦方向の脱落力価: n = 11

e 縦方向コンパートメント力価: 1 日目: n = 5

fn = 1 マウス

補足図 3:

連絡先の場合は an = 12、インデックスの場合は n = 2

縦方向の脱落の場合は bn = 27、インデックスの場合は n = 4

縦方向脱落の場合は cn = 14、インデックスの場合は n = 2

縦方向の脱落の場合は dn = 15、インデックスの場合は n = 2

縦方向の脱落の場合は en = 13、インデックスの場合は n = 2

縦方向の脱落の場合は fn = 8、インデックスの場合は n = 2

縦方向の脱落の場合は gn = 12、インデックスの場合は n = 2

補足図 4:

個々の URT サンプルの場合は an = 19 (PBS n = 6、r-WA-1 n = 4、ORF6 n = 5、ORF8 n = 4)、個々の肺サンプルの場合は bn = 21 (PBS n = 6、r-WA-1) 1 n = 5、ORF6 n = 5、ORF8 n = 5)

補足図 5:

r-WA-1 縦方向の重量: インデックス n = 4、接触 n = 16、縦方向の生存 (死亡): インデックス: n = 3、接触 n = 14

b ORF6 縦方向の重量: インデックス n = 2、接触 n = 14、縦方向の生存 (死亡): インデックス: n = 2、接触 n = 7

c ORF8 縦方向の重量: インデックス n = 2、接触 n = 13、縦方向の生存 (死亡): インデックス: n = 2、接触 n = 6

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成されたすべてのデータは、補足情報/ソースデータファイルで提供されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

https://covariants.org。

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リファレンスをダウンロードする

マウスモノクローナルSARS-CoV N抗体1C7を寄贈していただいたマウント・サイナイのアイカーン医科大学のトーマス・M・モラン氏、テキサス生物医学研究所のルイス・マルティネス・ソブリド氏、エモリー医科大学のメフル・スタール氏、ベンジャミン氏に感謝します。ピンスキー、スタンフォード大学、バリアントの寄贈に対して。ソースデータファイルの作成にご協力いただいた Ashley Fisher 氏と Nicole Rondeau 氏に感謝します。私たちのデータについて重要な情報を提供してくださった SARS-CoV-2 ウイルス進化評価 (SAVE) プログラムに感謝します。マウス鼻咽頭の組織病理学は、NYUMC 実験病理学研究研究所 (RRID: SCR_017928) の Mark Alu と Branka Brukner Dabovic によって実施されました。 Experimental Pathology Research Laboratory と NYU Genome Technology Core はどちらも、NYU Cancer Center 支援助成金 P30CA016087 と NYU Langone の Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center によって支援されており、Vectra Polaris マルチスペクトルスキャナは Shared Instrument Grant S10 OD021747 を通じて購入されました。また、NYU Langone 抗菌耐性病原体 (AMR) プログラムに感謝し、この研究で使用されたすべてのウイルスのディープシーケンスを行った Adriana Heguy と NYU Genome Technology Core のチームに感謝します。研究はNIH/NIAIDからの助成金によって部分的に支援された：R01AI143639からMD、K08AI141759からMBO、R01AI143861からKMK、DK093668からKC、およびT32AI007180。ニューヨーク大学グロスマン医科大学における組換えSARS-CoV-2に関する研究はいずれもNIAIDから資金提供を受けていない。研究はさらに、Vilcek Institute of Graduation Biomedical Sciences およびニューヨーク大学グロスマン医科大学 Startup Fund によって支援されました。

Bruno A. Rodriguez-Rodriguez、Grace O. Ciabattoni などの著者も同様に貢献しました。

この作品は、Mila B Ortigoza、Meike Dittmann の著者が共同で監修しました。

ニューヨーク大学グロスマン医学部微生物学科、ニューヨーク、ニューヨーク、10016、米国

ブルーノ・A・ロドリゲス＝ロドリゲス、グレース・O・チャバットーニ、ラルフ・デューラー、アナ・M・バレロ＝ヒメネス、スティーヴン・T・ヨン、キートン・M・クロス、オースティン・R・シンレバー、ルーシー・バーナード＝ライション、ホアキン・ロドリゲス・ガルバン、カマル・M・カンナ、ミラ・B・オルティゴザ＆マイケ・ディットマン

医学部/感染症および免疫部門、ニューヨーク大学グロスマン医科大学、ニューヨーク、ニューヨーク、10016、米国

ラルフ・デューラー、ルドヴィック・デヴィーニュ & ミラ・B・オルティゴザ

ワクチンセンター、ニューヨーク大学グロスマン医学、ニューヨーク、ニューヨーク、10016、米国

ラルフ・ドゥアー

微生物学および免疫学部、メリーランド大学医学部病原体研究センター、ボルチモア、メリーランド州、21201、米国

マリサ・E・マクグラス＆マシュー・B・フリーマン

合成生物学およびバイオエネルギー部門、J. Craig Venter Institute、ロックビル、メリーランド州、20850、米国

サンジェイ・ヴァシー＆ヨン・シュエ

ニューヨーク大学グロスマン医学部病理学教室、ニューヨーク、ニューヨーク、10016、米国

シンシア・A・ルーミス

パールマターがんセンター、ニューヨーク大学ランゴンヘルス、ニューヨーク、ニューヨーク、10016、米国

カマル・M・カンナ

ペンシルベニア大学ペレルマン医学部、消化器病学および肝臓病科、ペンシルベニア大学ペレルマン医科大学、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、19104、米国

ケン・キャドウェル

ペンシルベニア大学ペレルマン医学部システム薬理学およびトランスレーショナル治療学部門、ペンシルバニア州フィラデルフィア、19104、米国

ケン・キャドウェル

ペンシルベニア大学ペレルマン医科大学、病理学および臨床検査医学科、ペンシルバニア州フィラデルフィア、19104、米国

ケン・キャドウェル

高封じ込め研究所 - 科学研究局、NYU Langone Health、ニューヨーク、ニューヨーク、10016、米国

ルドヴィク・デヴィーニュ

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BAR-R.: 概念化、方法論、検証、形式分析、調査、執筆 – オリジナル草案、視覚化。 GOC: 概念化、方法論、検証、形式分析、調査、執筆 – レビューと編集、視覚化。 RD: 概念化、方法論、検証、形式分析、調査、執筆 – レビューと編集、視覚化。 AMV-J.: 概念化、方法論、調査、執筆 – レビューと編集。 STY: 方法論、調査、執筆 – レビューと編集。 KMC: 概念化、方法論、調査、執筆 – レビューと編集。 ARS: 方法論、調査、執筆 – レビューと編集。 LB-R.: 概念化、方法論、調査、執筆 – レビューと編集。 JJRG: 方法論、調査、執筆 – レビューと編集。 MEM: 方法論、リソース、執筆 - レビューと編集。 SV: 方法論、リソース。 Yong Xue: 方法論、リソース。シンシア・ルーミス: 方法論、監督。 KMK: 方法論、監督、資金調達。 Kenneth Cadwell: 方法論、監督、資金調達。 Ludovic Desvignes: 方法論、リソース、監督、執筆 – レビューと編集。マシュー・B・フリーマン: 概念化、方法論、リソース、監督、資金調達、執筆 – レビューと編集。 Mila B Ortigoza: 概念化、方法論、形式的分析、調査、執筆 - 原案、視覚化、監督、資金調達。メイケ・ディットマン: 概念化、方法論、形式分析、調査、執筆 - 原案、視覚化、監督、資金調達。

ミラ・B・オルティゴザまたはメイケ・ディットマンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Nicole M. Bouvier と他の匿名の査読者に感謝します。査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Rodriguez-Rodriguez、BA、Ciabattoni、GO、Duerr、R. 他新生児マウスモデルは、SARS-CoV-2 変異体の伝播性を特徴づけ、ORF8 の役割を明らかにしました。 Nat Commun 14、3026 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

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受信日: 2022 年 10 月 21 日

受理日: 2023 年 5 月 15 日

公開日: 2023 年 5 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

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